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【科研聚焦】NAR|张恒团队阐释AcrIIA17和AcrIIA18抑制CRISPR-Cas9系统的分子机制

发布时间: 2022-05-13  浏览次数: 10

  细菌利用CRISPR-Cas 适应性免疫系统切割噬菌体等移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs),保护自身遗传信息的完整性。CRISPR 相关的基因编辑工具以其高效、简便等优势成为生命医学领域最前沿的技术之一。在细菌-MGEs互作的博弈与协同进化过程中,MGEs也进化出了抗CRISPR蛋白(anti-CRISPR proteins,Acrs)抑制CRISPR-Cas系统。最近有报道指出,一些非噬菌体来源的Acrs,如AcrIIA17和AcrIIA18,可以通过调节sgRNA来抑制Cas9蛋白活性1,但其抑制机制尚不清楚。

  近期,天津医科大学张恒教授课题组在Nucleic Acids Research杂志上发表了题为:Inhibition mechanisms of CRISPR-Cas9 by AcrIIA17 and AcrIIA18的文章,详细阐释了AcrIIA17和AcrIIA18抑制CRISPR-Cas系统的机制。

  CRISPR-Cas系统由成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成,是细菌和古细菌的适应性免疫系统,用于抵抗外来移动遗传元件的入侵。CRISPR-Cas系统可以分为六种类型2,其中基于II型CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术已被广泛用于基础研究和转化应用。到目前为止,已经发现了二十多种靶向Cas9系统的Acrs蛋白,它们分别在不同阶段以不同的方式抑制Cas9系统。其中一些主要通过结合Cas9并阻碍其发生必需的构象变化来抑制CRISPR-Cas9系统,例如,AcrIIA14、AcrIIC1和AcrIIC3结合Cas9的HNH核酸酶结构域,使其处于无催化活性的构象。还有一些Acrs通过模仿PAM序列,结合Cas9,阻止底物DNA结合。与之前发现的II型Acrs不同,AcrIIA17-18大部分来源于非噬菌体,并通过调控sgRNA来抑制CRISPR-Cas系统1

  为了研究AcrIIA17的调控机制,作者使用AlphaFold2预测了AcrIIA17的结构,并通过DNA切割和EMSA等体外生化实验验证AcrIIA17与Cas9之间的相互作用,发现AcrIIA17与NmeCas9的作用强于SpyCas9。利用pull down和ITC实验,作者发现AcrIIA17通过与NmeCas9的BH结构域结合,阻碍了Cas9-sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)复合物的组装,最终抑制CRISPR-Cas9系统(图一)。

图一

  为了研究AcrIIA18的抑制机制,作者首先通过X射线晶体学方法解析了AcrIIA18的高分辨率晶体结构。AcrIIA18包含一个N末端结构域(N-terminal domain, NTD)和一个C末端结构域(C-terminal domain CTD)。由于暴露在溶剂中的带电残基可能参与底物结合和催化,作者在NTD和CTD结构域表面选择了13个带电残基进行点突变和功能评估,发现NTD上的V形口袋对AcrIIA18发挥抑制作用至关重要。通过体外RNA切割等一系列生化实验,作者发现AcrIIA18可以将sgRNA的spacer区域切割至15nt,切割后的sgRNA不足以激活Cas9的内切酶活性,从而抑制CRISPR-Cas9系统(图二)。

图二

  综上所述,该研究从生物化学与结构生物学的角度阐释了AcrIIA17和AcrIIA18抑制CRISPR-Cas9系统的分子机制。AcrIIA17与Cas9的BH结构域结合,抑制Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的组装;AcrIIA18则通过切割sgRNA,抑制CRISPR-Cas系统。该研究结果不仅为II型Acrs抑制CRISPR-Cas9系统的机制提供了新的见解,并且可能为开发CRISPR-Cas9系统调控工具提供理论依据。

  威尼斯官方入口—welcome张恒教授和银行博士为本文共同通讯作者,2021级博士生王枭燊和李徐梓超为本文的共同第一作者。该工作得到了上海同步辐射光源的帮助和支持。

  参考文献:

  【1】Mahendra, C., Christie, K.A., Osuna, B.A., Pinilla-Redondo, R., Kleinstiver, B.P. and Bondy-Denomy, J. (2020) Broad-spectrum anti-CRISPR proteins facilitate horizontal gene transfer. Nature microbiology, 5, 620-629.

  【2】Mohanraju, P., Makarova, K.S., Zetsche, B., Zhang, F., Koonin, E.V. and Van der Oost, J. (2016) Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science, 353.

  原文链接:https://doi.org/10.1093/nar/gkab1197

  【作者介绍】

  张恒

  威尼斯官方入口—welcome教授、博导。2020年9月加入天津医科大学建立结构生物化学实验室。张恒博士从事基因转录、编辑及病原菌入侵宿主相关的蛋白质结构功能研究。近五年来,张恒博士发表SCI论文14篇;其中通讯作者3篇,包括Nature Structural & Molecular Biology、Nucleic Acids Research(2篇);第一作者论文9篇,包括Cell Host & Microbe、Nature Chemical Biology (2篇)、Proc Natl Acad Sci USA(PNAS)、Genes & Development、Cell Research和Cell Reports等。


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